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激光共聚焦顯微鏡的基本觀察步驟

更新時(shí)間:2022-09-01      點(diǎn)擊次數(shù):2479
  激光共聚焦顯微鏡是一種高分辨率的顯微成像技術(shù)。普通的熒光光學(xué)顯微鏡在對(duì)較厚的標(biāo)本(例如細(xì)胞)進(jìn)行觀察時(shí),來自觀察點(diǎn)鄰近區(qū)域的熒光會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)的分辨率形成較大的干擾。共聚焦顯微技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于,每次只對(duì)空間上的一個(gè)點(diǎn)(焦點(diǎn))進(jìn)行成像,再通過計(jì)算機(jī)控制的一點(diǎn)一點(diǎn)的掃描形成標(biāo)本的二維或者三維圖象。在此過程中,來自焦點(diǎn)以外的光信號(hào)不會(huì)對(duì)圖像形成干擾,從而大大提高了顯微圖象的清晰度和細(xì)節(jié)分辨能力。
 
  樣品制備是檢測(cè)前的關(guān)鍵步驟,樣品需要用熒光探針(單,雙和三)標(biāo)記。標(biāo)本可以是固定的或活組織,或固定或活的貼壁培養(yǎng)。細(xì)胞應(yīng)在共聚焦特殊培養(yǎng)皿或蓋玻片,懸浮細(xì)胞,萼片或滴劑和蓋玻片上培養(yǎng),覆蓋。樣品厚度約1~2mm,蓋玻片厚度應(yīng)小于0.17mm,滑塊厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間,表面光滑,厚度均勻,并且沒有明顯的干擾熒光。固定樣品通常用密封片密封,通常使用通過使用pH 8.5-9的PBS制備的甘油密封。
 
  根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制備樣品完畢后。即可進(jìn)行觀察,基本步驟如下:
 
  (1)開啟儀器電源及光源:一般先開啟激光共聚焦顯微鏡和激光器,再啟動(dòng)計(jì)算機(jī),然后啟動(dòng)操作軟件,設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長,選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊。以便光電倍增管檢測(cè)器能得到足夠的信號(hào)結(jié)果。
 
  (2)設(shè)置相應(yīng)的掃描方式:在目視模式下.調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù),在顯微鏡下找到需要檢測(cè)的細(xì)胞。切換到掃描模式,調(diào)整雙孔針和激光強(qiáng)度參數(shù),即可得到清晰的共聚焦圖像。
 
  (3)獲取圖像:選擇合適的圖像分辨率,將樣品完整掃描后,保存圖像結(jié)果即可。
 
  (4)關(guān)閉儀器:儀器測(cè)定樣品結(jié)束后,先關(guān)閉激光器部分,計(jì)算機(jī)仍可繼續(xù)進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個(gè)激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng),則應(yīng)該在激光器關(guān)閉后,待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計(jì)算機(jī)及總開關(guān)。
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